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近日，星空online官方网站颜德岳院士课题组联合生命科学技术星空online官方网站夏小霞教授课题组在Journal of the American Chemical Society期刊发表题为“Chemically Engineered Affinity Protein Drugs for Covalent Targeted Cancer Therapy”的研究成果。 同题参见星空online官方网站和变革性分子前沿科学中心为第一完成单位。夏雪霖（博士后）和高文慧（博士生）为论文的共同第一作者，星空online官方网站颜德岳院士、夏雪霖博士，和生命科学技术星空online官方网站的夏小霞教授为论文的共同通讯作者。

如何在较快的血液清除和有效的肿瘤积累之间取得平衡，由于天然细胞系统对Uaas的识别限制，各类共价弹头主要通过封装在非天然氨基酸（Uaas）中，探索一种通用的高产方法来制备含有共价弹头的蛋白药物很有必要。 继续了解仍然是其临床应用要面对的主要挑战。共价靶向模式，可通过蛋白药物与其受体之间不可逆的共价结合，将药物的药效学效应与其药代动力学解耦，为小型亲和蛋白的临床应用提供有前途的解决方案。目前，具有出色的肿瘤靶向性能。然而，其产物蛋白的产量相对较低（低于10mg/L），然而，由于它们的体积小，随后通过遗传密码子扩展技术特异性地编码到蛋白药物的氨基酸序列中。这种将Uaas引入到蛋白质中的技术方法相当巧妙，想要实现共价蛋白药物的大规模制备仍具有一定的挑战性。因此，亲和蛋白代表多种已被充分探索的小型工程化支架蛋白，

 图1. 化学修饰策略构建共价靶向亲和蛋白药物的示意图

针对这一现状，作者开发了一种化学修饰策略来构建共价靶向亲和蛋白药物，通过将基于六价硫氟交换（SuFEx）化学的马来酰亚胺取代的芳基氟硫酸盐（MFS）连接子直接修饰到蛋白药物的特定位点，实现亲和蛋白与其靶标受体的共价连接。 同题参见基于这一策略生产的蛋白药物无需依赖遗传密码子扩展技术，通过传统发酵工程即可批量制备（图1a）。作为概念验证，MFS连接子修饰的亲和体蛋白药物（Affibody-protein drug）与其靶标HER2（人表皮生长因子受体 2）的共价结合效率超过72%，细胞摄取率比其非共价对照组高185%。在小鼠实验中，共价Affibody-protein药物的肿瘤滞留能力是对照组的2.01倍，最终几乎实现了对肿瘤生长的完全抑制。同时，在另一种靶向EGFR（表皮生长因子受体）的单体蛋白药物（Monobody-protein drug）中也获得了类似的增强治疗效果。简而言之，这种简单的化学修饰策略为大规模制备共价靶向亲和蛋白药物提供了一个通用平台。有望加速蛋白质治疗在各种疾病中的应用。

不同于传统蛋白质/靶点之间可逆的亲和解离过程，作者构建的共价靶向亲和蛋白药物通过“邻近触发”的SuFEx反应与靶标受体实现不可逆的共价键结合。该过程依赖于MFS连接子中的芳基氟磺酸酯与靶标中的亲核性氨基酸残基之间的特异性反应，从而赋予药物快速肿瘤靶向、永久性受体结合、高效药物富集以及快速残留代谢等优势，展现出一种极具潜力的药物作用模式。通过将开发的MFS连接子化学修饰至亲和蛋白药物上，作者构建了9种靶向HER2靶标及9种靶向EGFR靶标的共价亲和蛋白药物候选物，并从这18种候选物中快速筛选出对靶标具有最高共价交联效率的药物，组织了系统的表征。

图2. 共价靶向亲和蛋白药物的晶体结构和共价效率筛选

首先，作者选择了两种常见的亲和蛋白Affibody（亲和体，ZHER2:342）和Monobody（单体，Adnectin）作为靶向结构单元，分别与PE24（铜绿假单胞菌外毒素，一种具有潜力的抗癌活性成分）偶联，构建蛋白药物。通过分析蛋白/靶标复合物的晶体结构数据，选择合适的氨基酸位点对亲和蛋白进行半胱氨酸突变（图2a、b）。其次，作者合成了多种不同长度的MFS连接子，以满足蛋白/靶标诱发SuFEx反应的选择性（图1b、c）。接下来，作者利用巯基与马来酰亚胺之间的加成反应将这些MFS连接子分别连接到支架蛋白上，生成多种候选共价药物。最后，将获得的候选共价支架蛋白药物分别与其靶标受体孵育，通过Western blot实验分析共价交联效率，筛选出交联效率最高的共价支架蛋白药物作为优选药物进行后续研究（图1d。图2c、d）。

 图3. 共价靶向亲和蛋白药物增强肿瘤滞留和药效

为了评估共价结合是否能够增强亲和蛋白药物在肿瘤中的积累，作者研究了Cy5.5标记的ZHER2:342-25Cys-PE24和ZHER2:342-25MFS03-PE24在SKOV-3荷瘤小鼠中的药物富集情况。总的来说如图3a所示，与共价靶向的ZHER2:342-25Cys-PE24相比，共价靶向的ZHER2:342-25MFS03-PE24在肿瘤中的积累更为迅速，摄取量更高，并且在注射后48小时，荧光强度仍保持在较高水平。接下来，作者建立了HER2高表达的SKOV-3小鼠肿瘤模型（图3b），经过30天的治疗后，ZHER2:342-25MFS03-PE24组的肿瘤生长明显停止生长，部分肿瘤甚至出现体积缩小，显著优于其他处理组，表明ZHER2:342-25MFS03-PE24具有共价增强的抗肿瘤活性（图3c）。此外，ZHER2:342-25MFS03-PE24组的组织学（H&E染色）、免疫荧光（TUNEL）和免疫组织化学（Ki67）分析进一步证实了其优异的体内抗肿瘤活性（图3d）。

为了进一步验证这一观点，作者随后在EGFR高表达的A-431肿瘤模型中研究了Adnectin-17MFS01-PE24的体内药物滞留和抗肿瘤性能。如图3e所示，与非共价靶向的Adnectin-17Cys-PE24组相比，共价靶向的Adnectin-17MFS01-PE24组在肿瘤部位表现出增强且持久的药物富集。在A-431肿瘤模型的疗效实验中（图3f），Adnectin-17MFS01-PE24组肿瘤生长显著放缓（图3g），且其H&E、TUNEL和Ki67染色结果均显示出最优的抗肿瘤效果（图3h），进一步证实了共价结合在增强抗肿瘤活性中的重要作用。

综上所述，作者通过采用化学修饰策略为构建共价靶向亲和蛋白药物提供了一种全新的方法。由于这些共价蛋白药物采用传统发酵技术生产，不仅简化了生产流程，还显著降低了成本，使得含SuFEx共价弹头的蛋白药物更易普及，造福更多患者。此外，在共价药物构建策略中，亲和蛋白不仅能与蛋白毒素融合，还能与常见的小分子治疗剂（如化学细胞毒素或放射性药物）结合，确保化学修饰策略的广泛适用性，能够灵活适配各种治疗剂，针对不同疾病提供解决方案。同时，随着AlphaFold 3等智能工具的快速发展，蛋白质结构与相互作用的预测变得更加便捷，确定共价弹头的插入位置将变得更加简单，这为赋予大量蛋白质共价结合能力提供了广泛的可能性。作者希望本文提出的简单化学修饰策略能够应用到更广泛的蛋白中去，助力蛋白药物的进一步发展。

该研究得到星空online官方网站自然科学基金委的资助。

论文链接：

https://doi.org/10.1021/jacs.5c02212